Día Mundial de la tuberculosis: avances en el diagnóstico por el Laboratorio






Ramiro Salazar Irigoyen

Médico, Patólogo Clínico






La tuberculosis (TB) es causada por un grupo de bacterias del orden Actinomicetales de la familia Mycobacteriaceae, (el agente causal más frecuente es Mycobacterium tuberculosis), se considera una afectación infectocontagiosa de evolución aguda, subaguda o crónica, siendo ésta la más frecuente. Se caracteriza por la formación de granulomas que pueden afectar a distintos órganos siendo la TB pulmonar la más frecuente con 80 al 85% de los casos. La manifestación más importante es la tos con expectoración mucopurulenta de más de 15 días de duración.

El 24 de marzo se celebra el Día Mundial de la Tuberculosis, ya que un día como ese del año 1882, el doctor Robert Koch anunció al mundo científico que había descubierto al bacilo causante de la enfermedad, hecho histórico que permitió iniciar avances en el diagnóstico y el tratamiento de la tuberculosis. En la actualidad ese día nos invita a concientizar sobre las consecuencias sanitarias, sociales y económicas de esta enfermedad y reflexionar acciones para intensificar esfuerzos en todos los ámbitos para acabar o al menos disminuir esta epidemia mundial. Una de las acciones más importantes, sin duda, es optimizar el diagnóstico por el Laboratorio.

En 2014, la Asamblea Mundial de la Salud aprobó por unanimidad el programa "Fin a la Tb”, una estrategia de la Organización Mundial de la Salud (OMS) con proyección a 20 años para que los Países reduzcan para 2030 la incidencia de tuberculosis en un 80% y las muertes por esta enfermedad en un 90%. Una parte fundamental de las medidas es el diagnóstico precoz de la tuberculosis incluyendo las pruebas de sensibilidad a los antituberculosos y el cribado sistemático de los contactos y los grupos de alto riesgo, es decir se considera que el Laboratorio Clínico deberá tener una mayor y más activa participación en las estrategias de combate a esta enfermedad.


EL LABORATORIO Y EL DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS


La tuberculosis puede ser:


Tuberculosis latente o infección tuberculosa latente (ITBL): cuando la bacteria permanece en estado inactivo y no presentas síntomas, no es contagiosa, pero puede progresar a tuberculosis activa


Tuberculosis activa: presenta habitualmente síntomas en las primeras semanas o años después de la infección, en la mayoría de los casos, es contagiosa.


La prueba de tuberculina y la detección de interferón gamma, conocidas como pruebas IGRAs por sus siglas en inglés (Interferon Gamma Release Assays), pueden detectar una infección por el Mycobacterium tuberculosis, pero no son capaces de distinguir entre la infección y enfermedad.


La tuberculosis activa debe diagnosticarse a través de la identificación de la bacteria por métodos microbiológicos o por biología molecular.


La prueba de tuberculina (PT) es una técnica desarrollada por Koch y descrita por Mantoux en 1912, consiste en la aplicación de proteína purificada (PPD) de M. tuberculosis en la piel, lo que induce una reacción de hipersensibilidad cutánea manifestada por eritema e induración visible luego de 48 a 72 horas. Una prueba negativa no excluye enfermedad tuberculosa y una prueba positiva no equivale a enfermedad tuberculosa, por lo que su sensibilidad no es muy alta y puede llevar a confusiones diagnósticas.


Los resultados falsos negativos, que van del 10 al 30% de los casos, pueden deberse a:


Factores dependientes del huésped:

  • edad (menores de 6 meses y ancianos).

  • infecciones (VIH, sarampión, varicela, parotiditis, TB, fiebre tifoidea, brucelosis, tosferina, lepra)

  • insuficiencia renal crónica, o desnutrición grave.

  • vacunación con virus vivos (sarampión, parotiditis, poliomielitis)

  • tratamientos que produzcan inmunosupresión (corticosteroides o inmunosupresores),

  • periodo de ventana en la positivización

  • TB diseminada o miliar

  • meningitis.

Factores relacionados con la técnica:

  • administración y lectura defectuosas.

  • exposición de la tuberculina a la luz o al calor o desnaturalización por caducidad


Interferon G Release Assays (IGRAS) es una técnica que mide la liberación del interferón por los linfocitos, tiene como ventaja sobre la tuberculina que se realiza en una muestra de sangre, por lo que no se requiere de una segunda visita del paciente para su lectura. Son más específicos que el PPD, con una sensibilidad similar.


Las dos pruebas son mediciones cuantitativas y se considera una PT positiva si es ≥ 5 mm y una prueba IGRA se considera positiva si es ≥ 0,35 UI/ml, aunque se han considerado otros puntos de corte como 0,10 o 0,70 UI/ml, para los cuales variaría la sensibilidad de la prueba.


La concordancia entre la PT y el IGRA se ve afectada en pacientes con las enfermedades inflamatorias mediadas por la inmunidad (EIMI) y en mayor medida en la enfermedad inflamatoria intestinal y corticoterapia. En estos casos los estudios recientes sugieren que es preferible utilizar como método diagnóstico de infección latente las pruebas IGRA.


Recientemente, ha aparecido una nueva generación del QuantiFERON, el QFN-TB Gold Plus, que incluye diferentes mezclas de péptidos que permiten estimular, además de a los linfocitos T CD4, a los linfocitos T CD8, en conocimiento que muchas inmunodeficiencias están asociadas con una disminución de las células T CD4, esta nueva versión de QFN aumentaría la sensibilidad en diferentes grupos de pacientes inmunodeprimidos, disminuyendo la cantidad de resultados indeterminados. Con esta técnica los resultados pueden ser:


Negativos: si la prueba no detectó respuesta de interferón gama a los antígenos de M. tuberculosis y la interpretación sería que la infección es poco probable.

Positivo: si se detecta respuesta a interferón. Este resultado debe interpretarse con mucho cuidado en personas con bajo riesgo de enfermedad y se debería repetir la muestra luego de varios días.

Indeterminado: no se puede determinar con precisión el resultado y las causas de esto podría ser: personas con anticuerpos heterófilos o inespecíficos, recuento disminuido de linfocitos o incapacidad de linfocitos de sintetizar interferón gamma.


En sospecha de enfermedad tuberculosa el diagnóstico microbiológico de rutina se basa en:


1.- Demostración de bacilos ácido-alcohol resistentes mediante tinciones especificas (Zhiel-Neelsen y la tinción de auramina), porque las micobacterias debido a la alta cantidad de lípidos de pared que poseen, no se colorean con las tinciones de rutina. La demostración de bacilos alcohol ácido resistentes (BAAR) en un examen microscópico sólo proporciona un dato de presunción diagnóstica. Y la no observación de BAAR no descarta el diagnóstico, ya que la tinción es un procedimiento con alta especificidad, pero baja sensibilidad, ya que deben existir más de 10,000 bacilos/mm y entre 30 a 50% de los pacientes no son bacilíferos.


Las tinciones específicas o baciloscopia (BK) además tienen otras limitaciones:

detecta bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR), pero no diferencia M. tuberculosis de otras micobacterias no tuberculosas (MNT), no detecta la resistencia a los fármacos.


2.- El aislamiento de M. tuberculosis por distintos medios de cultivo: sólidos, radiométricos, líquidos no radiométricos y bifásicos.

Los medios sólidos como el Lowestein-Jensen precisa 8 semanas de incubación, es decir es muy lento en la entrega de resultados, pero presentan una alta sensibilidad, ya que es capaz de detectar entre 10 y 100 bacterias/mL por muestra para que resulte positivo, tiene algunas ventajas adicionales: permite la identificación de las diferentes micobacterias y realizar estudios de susceptibilidad a fármacos antituberculosos.


Se recomienda realizar estudios de susceptibilidad a:

  • pacientes con TB grave

  • fracaso terapéutico o pacientes con recidiva y tratamiento previo

  • exposición a un caso índice resistente

  • inmigrantes procedentes de países con alta incidencia de resistencia primaria


Los medios líquidos de cultivo automatizados permiten detectar el crecimiento bacteriano entre 7 y 10 días antes que los medios sólidos. Los métodos de cultivo radiometricos (BACTEC 12B) detectan el crecimiento de la bacteria midiendo la cantidad de CO2 producida por la metabolización de sustratos marcados con C14. Estos métodos son más rápidos que los medios sólidos: precisa 2 o 3 semanas para detectar crecimiento y son más sensibles.


Los métodos bifasicos (fase sólida y fase líquida) son no radiometricos, más sensibles, aunque algo más lentos que el sistema BACTEC.


Las técnicas de hemocultivo para micobacterias son de gran utilidad en pacientes con formas diseminadas de TB.

3. La identificación de las cepas de M. Tuberculosis: una vez obtenido el crecimiento de micobacterias puede realizarse la identificación mediante pruebas bioquímicas sencillas o por técnicas de cromatografía y sondas genéticas que permiten diferenciar las distintas especies de micobacterias.


Adenosina desaminasa (ADA). Es una enzima que interviene en el catabolismo de las purinas producidas por monocitos y macrófagos, la cual se encuentra elevada en la TB, especialmente en serosas (el punto de corte de 8 a 10 UI/L para líquido cefalorraquídeo y de 40UI/L para líquido pleural). Su sensibilidad es de 75 a 98%, y es la prueba más sensible de todas en las formas de TB que afectan a serosas. Puede mejorar el diagnóstico llegando a más del 90%, cuando se combina con otras pruebas: porcentaje de linfocitos igual o mayor al 50%, proteínas y deshidrogenasa láctica elevadas y glucosa inferior a 25 mg/dL en LCR o líquido pleural, tuberculina positiva o producción de interferón gamma positiva.


PRUEBAS DE DIAGNOSTICO RAPIDO


En los últimos años se ha desarrollado técnicas para la detección de micobacterias, especialmente M. tuberculosis, directamente de muestras clínicas, que tienen como fundamento la amplificación de diferentes dianas genéticas; sin embargo, hasta el momento se ha demostrado que en muestras de pacientes con diagnóstico de TB, las técnicas moleculares reflejan variabilidad en los resultados, dependiendo del sistema de amplificación utilizado y del origen de las muestras, por lo que al igual que en otras pruebas de Laboratorio, el grado de sospecha clínica es fundamental para la interpretación de los resultados.


En relación al estudio de la resistencia a los fármacos, en los últimos años se han dilucidado las bases moleculares de la resistencia encontrando que las mutaciones implicadas en resistencia a la rifampicina (RIF) se hallan en la subunidad-beta de la RNA polimerasa (rpoB); y las asociadas a isoniacida (INH) se localizan en el gen de la peróxido catalasa y paulatinamente se han ido descubriendo mutaciones relacionadas con resistencias al resto de fármacos de primera línea, y a algunos de segunda línea.


De esta manera, podemos decir que en la actualidad existen pruebas diagnósticas que permiten la detección rápida de la tuberculosis y de la tuberculosis farmacorresistente y consecuentemente iniciar un tratamiento oportuno, y al mismo tiempo colaborar de manera decisiva con la salud pública evitando o disminuyendo la transmisión de la enfermedad.


Algunas pruebas moleculares que se utilizan con estos fines son:

Xpert MTB/Rif.: es una prueba molecular de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real que detecta simultáneamente la presencia de M. tuberculosis y la resistencia a la rifampicina (TB-RR) en aproximadamente 2 h. Para detectar resistencia a rifampicina (R), la sensibilidad es de 95%, con una especificidad del 98%. pero por las discrepancias de resultados con las pruebas de sensibilidad realizadas a partir de colonias de medios sólidos, se recomienda repetir el Xpert MTB/Rif en una segunda muestra, especialmente en pacientes que no están en grupos de riesgo de resistencia a rifampicina y en países con baja prevalencia de TB-RR


La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda el uso de Xpert MTB/Rif en muestras pulmonares en los siguientes casos:

En lugar de BK y cultivo para el diagnóstico inicial de adultos con sospecha de tuberculosis multidrogo resistencia (TB-MDR) o tuberculosis asociada a HIV (TB/ HIV)

En adultos con BK negativas con sospecha de TB sin riesgo de TB-MDR o TB-VIH


En muestras extra pulmonares en adultos la OMS recomienda:

En líquido céfalo-raquídeo (LCR): en pacientes con sospecha de meningitis tuberculosa en lugar de BK y cultivo

Muestras de ganglios linfáticos y otros tejidos de pacientes sospechosos de TB extra pulmonar.


Otras formas de tuberculosis extrapulmonar que pueden ser investigadas por esta técnica son: la tuberculosis pleural, osteoarticular, genitourinaria, peritoneal, pericárdica y la tuberculosis diseminada.


En niños, el uso de esta prueba en reemplazo de BK y cultivo como prueba de diagnóstico inicial en sospecha de TB pulmonar, TB-MDR o TB/HIV.


También la OMS recomienda que las todas las muestras extrapulmonares con resultado negativo de Xpert deben ser cultivadas, aunque sus resultados sean muy tardíos.


La prueba molecular más el cultivo en medio líquido (MGIT 960) definen el resultado positivo o negativo con alta sensibilidad y especificidad, mientras que la prueba de sensibilidad en medio sólido permite cuantificar la proporción de bacilos que son resistentes a la droga investigada.


XPERT ULTRA utiliza la misma tecnología Xpert pero con mayor sensibilidad para detectar TB en muestras con BK negativa, mientras el Xpert MTB/RIF tiene un límite de detección de 130 ufc/mL, el Xpert MTB/RIF Ultra tiene un límite de detección a 10 ufc/mL, con una sensibilidad mayor al 90% y una especificidad de 100%.


Ensayos con Sondas en Línea Line Probe Assays (LPA) son pruebas moleculares que utilizan tiras reactivas de nitrocelulosa (tecnología DNA Strip) que contienen regiones moleculares parciales o sondas de los genes de resistencia. Utiliza esta técnica Genotype®MDRTB plus que contienen regiones moleculares parciales que detectan mutaciones de resistencia a la rifampicina e isoniacida. La prueba puede realizarse directamente sobre una muestra de esputo con una sensibilidad de 95,7% para rifampicina, 95,8% para isoniacida y 95,3% para TB-MDR. Pero si la prueba se realiza a partir de cultivos la sensibilidad es del 100% para detectar resistencia a rifampicina, 97,5% para isoniacida y 96,9% para TB-MDR.


También y mediante técnicas similares se puede detectar mutaciones asociadas a resistencia a aminoglucósidos (AMG) y fluoroquinolonas (FQ), fármacos de segunda línea cuya resistencia determina la presencia de tuberculosis extensamente resistente (TB-XDR).

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